Assassin's Creed III là một trò chơi điện tử hành động-phiêu lưu góc nhìn người thứ ba, lấy bối cảnh một thế giới mở mà người chơi phải kết hợp kỹ năng ẩn giấu, di chuyển và tấn công để hoàn thành các nhiệm vụ. Người chơi vào vai ba nhân vật trong toàn bộ câu chuyện của trò chơi. Nhân vật chính là Desmond Miles, một Sát thủ thế kỷ 21, người khám phá những bí mật về Căn Hầm Của Người Đến Trước (Precursor Vault) có thể giúp Trái Đất tránh khỏi thảm họa vào ngày 21 tháng 12 năm 2012. Để giải đáp những bí mật, Desmond sử dụng cỗ máy Animus để sống lại những ký ức của hai người tổ tiên cùng sống trong khoảng thời gian diễn ra cuộc Cách mạng Mỹ. Tại thời điểm đầu trò chơi, người chơi sẽ vào vai Haytham Kenway, một Hiệp sĩ dòng Đền Anh truy tìm vị trí của Căn Hầm. Người thứ hai, cũng là nhân vật chính của trò chơi, là Ratonhnhaké:ton, con trai của Kenway và vợ của ông — một người thổ dân châu Mỹ. Để hòa nhập vào xã hội thuộc địa đương thời, Ratonhnhaké:ton sử dụng tên Connor. Vào vai Connor, người chơi được tiếp cận với một vùng hoang dã rộng lớn tên là Biên Giới (Frontier, lớn hơn Roma trong Assassin's Creed: Brotherhood khoảng 1,5 lần), cùng các thành phố Boston và New York. Người chơi cũng có thể khám phá một phần của Đông Duyên hải Hoa Kỳ và biển Caribe qua các chuyến hải hành của con tàu Aquila, với thuyền trưởng chính là Connor và người cố vấn là Robert Faulkner.

Các pha giao chiến cũng thay đổi, giờ đây cho phép Connor sử dụng vũ khí đôi để đối phó với nhiều kẻ địch cùng lúc. Connor còn có thể dùng súng hỏa mai, súng lục, các vũ khí thổ dân như rìu tomahawk, cung và tên, móc dây (dùng để kéo kẻ địch về phía người chơi, hoặc treo chúng lên cây). Con dao ẩn dưới tay trái cũng có tính năng chặn các đòn đánh, lột da thú săn hay thực hiện những đòn ám sát nóng. Người chơi có thể tránh được làn đạn của đối phương khi sử dụng một kẻ địch làm lá chắn. Máu sẽ tự hồi sau khi kết thúc giao chiến một thời gian, nên người chơi không còn cần phải mua máu dự trữ. Cơ chế ẩn giấu được làm lại, cho phép người chơi lợi dụng những yếu tố tự nhiên như bụi cỏ hoặc cây, hoặc nhập chung với bất kỳ nhóm hai người nào để giấu mình.

Hệ thống giả lập trong Assassin's Creed III mang đến những hiện tượng thiên nhiên mới như tuyết, sương mù và mưa. Các mùa trong năm cũng có thể thay đổi, ví dụ mùa hè và mùa đông. Điều này không chỉ thay đổi khung cảnh của thế giới mà còn ảnh hưởng đến gameplay, bởi vì trong tuyết thì người chơi sẽ thấy mình chạy chậm hơn. Tuyết rơi cũng ảnh hưởng đến tầm nhìn người chơi và kẻ địch. Không như những phần trước, phiên bản này bao gồm nhiều loài động vật từ vật nuôi (ngựa, cừu, chó) đến các loài hoang dã (nai, sói, gấu). Các loài hoang dã này chỉ sống trong khu vực Biên Giới, và người chơi có thể săn chúng lấy da hoặc lấy thịt để bán. Giá bán này phụ thuộc vào chất lượng của sản phẩm săn, vì thế trò chơi khuyến khích người chơi săn bắn bằng vũ khí nhẹ (ví dụ, cung tên, hoặc bẫy dùng với mồi).

Các hoạt động kinh tế diễn ra tại Davenport Homestead, nơi ở mới của Connor. Nơi đây thường có những đoàn xe buôn của những người thợ mộc, thợ may v.v. chịu ảnh hưởng của chiến tranh và rời khỏi quê nhà. Khi người chơi giúp đỡ họ, họ sẽ ở lại và ổn định sinh sống tại Homestead. Sau đó, người chơi có thể làm các món đồ thủ công và trao đổi với họ, rồi bán các sản phẩm đó cho các thành phố thông qua những đoàn xe/tàu hành hương. Qua hệ thống nhiệm vụ, người chơi dần dần làm tăng các mối quan hệ giữa những người dân với nhau và ở Homestead hình thành một ngôi làng nhỏ. Trang viên của người chơi và con tàu Aquila cũng có những tùy chọn nâng cấp.

Tính năng tuyển mộ thành viên của Assassin's Creed: Brotherhood cũng được làm lại. Người chơi có thể kết nạp thành viên khi hoàn thành những nhiệm vụ "giải phóng" (Liberation). Những thành viên Sát thủ có bộ kỹ năng nhiều hơn, cho phép người chơi tạo ra một vụ bạo loạn, giả mạo là đội hộ tống tù nhân, hoặc đóng vai bảo vệ. Các nhiệm vụ phụ của trò chơi bao gồm thu thập các trang niên giám, khám phá các đường hầm dưới mặt đất để xác định vị trí những trạm dịch chuyển nhanh, tham gia các câu lạc bộ săn bắn và đánh nhau, điều tra những bí ẩn lan truyền trong người dân khu biên giới về UFO và Sasquatch, các nhiệm vụ "peg-leg" mà Connor đến các thành trì dưới mặt đất hoặc ở những nơi hoang vu để khám phá huyền thoại về kho báu của Thuyền trưởng Kidd, cùng những nhiệm vụ khác.

Bằng con tàu chiến Aquila, Assassin's Creed III mang đến cho người chơi những cuộc viễn chinh trên biển. Trong những chuyến đi, các yếu tố môi trường như hướng gió và tốc gió, bão, sóng cao và đá ngầm đều ảnh hưởng đến việc điều khiển con tàu. Những cuộc chiến trên biển diễn ra với đại bác, đến từ dàn đại bác ở cả hai bên mạn thuyền, và những khẩu đại bác xoay được trên boong tàu. Con tàu Aquila được sử dụng cho các nhiệm vụ tàu lùng (Privateer), và cũng xuất hiện trong một số nhiệm vụ chính của trò chơi.

Phiên bản trên hệ máy Wii U của trò chơi có thêm những tính năng khác. Người chơi có thể thay đổi vũ khí khi đang thực hiện hành động khác, và bản đồ luôn hiện trên tay cầm Wii U Gamepad. Phiên bản này cũng hỗ trợ Off TV Play, một tính năng cho phép hiển thị màn hình chính lên màn hình trên tay cầm.

Phiên bản nhiều người chơi trong phần này được phát triển bởi Ubisoft Annecy. Ngoài các chế độ thông thường, ra mắt kiểu chơi Wolfpack, trong đó 1-4 người chơi phải truy lùng và ám sát các NPC nhất định trong một khoảng thời gian cho trước, và có 25 màn như vậy. Chế độ Domination mới là chế độ mà người chơi cùng đồng đội phải nắm giữ các khu vực trên bản đồ và bảo vệ chúng khỏi đội đối phương.